技术动态 » 盘点:分子诊断常用技术50年的沿革与进步

一、基于分子杂交的分子诊断技术


上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

 

(一)DNA印迹技术(Southernblot)


Southern于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等于1977年推出基于转印杂交的Northernblot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

 

(二)ASO反向斑点杂交(allele-specificoligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)


使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

 

(三)荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)


FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。

 

如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectralkaryotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

 

(四)多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)


MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。

 

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。

 

(五)生物芯片


1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。

 

1.微阵列芯片


(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-basedgenomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNParray)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%,表达谱芯片(geneexpression profiling array,GEParray):1999年,Duggan等首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(longnoncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。

 

相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;

 

(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。

 

2.微流控芯片


1992年Harrison等首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidicchip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。

 

目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。

 

二、核酸序列测定


测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。

 

()1代测序


1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。

 

Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。AppiedBiosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。

 

()2代测序


1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)

 

不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。

 

2.高通量第2代测序

 

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、IlluminaSolexa、ABISOLiD和LifeIon Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。

 

(三)第3代测序

 

第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、PacificBiosciences公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。

 

三、基于分子构象的分子诊断技术


(一)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(singlestrand conformation polymorphism,SSCP)

 

1970~1980年间,Fischer等与Orita等分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。

 

(二)变性高效液相色谱(denaturinghigh-performance liquid chromatography,dHPLC)

 

1997年,Oefner和Underhill建立了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。

 

(三)高分辨率熔解分析(high-resolutionmelting analysis,HRMA)

 

2003年,Wittwer等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。

 

如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。

 

四、定量PCR(quantitativePCR,qPCR)


相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。

 

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